Quân viễn chinh Pháp và Tây Ban Nha dò biết quân dân Định Tường phòng thủ tuyến kinh Bảo Định nghiêm ngặt nên đầu tiên chúng định tiến theo kinh Rạch Chanh. Nhưng bấy giờ kinh nầy bị cạn lấp, tàu chiến vào khó khăn, lại không nắm được tình hình phía bên kia sông Tiền, nên cuối cùng địch quyết định theo đường kinh Bảo Định, mặc dù biết con đường này có nhiều khó khăn, nguy hiểm.
Ngày 5-4-1861, liên quân Pháp – Tây Ban Nha với 1 chiến thuyền lớn, 6 pháo hạm nhỏ và nhiều súng trường, đại bác tập hợp tại vàm kinh Gù. Sau 20 ngày vất vả vì nạn dịch tả hoành hành, lại bị các bè hỏa công và thần công của lực lượng phòng ngự, cuối cùng địch đã phá được 8 cản hàn và 6 pháo đài phòng ngự.
Trên đường tiến công, chiều ngày 10-4-1861 quân Pháp bị thất bại lớn. Tại Bến Chùa (Trung Lương), pháo hạm Monge đã bị trúng ba quả thần công của quân ta, Trung tá Bourdais và 5 thủy thủ bỏ mạng. Sau này chỉ huy Liên quân là Đại tá Thủy quân Lục chiến Duquilo xác nhận, quân dân Định Tường rất gan dạ. Trung tá Bourdais chết là một thất bại lớn đối với chúng.
Còn cách thành khoảng 1.500m, bỗng đoàn quân viễn chinh nhìn thấy khói trong thành bốc cao, các pháo đài phòng ngự dọc đường đều tan rã và càng ngạc nhiên hơn khi lính do thám về báo rằng: cờ tam sắc đã treo trên cột cờ trong thành. Thì ra, địch đã dùng kế “dương đông kích tây”: trước đó hai ngày (10-4-1861), địch đã cho 3 pháo hạm khác phá cản hàn tại vàm cửa Tiểu, mặc cho pháo đài trên cù lao nã pháo truy đuổi, chúng vẫn chạy thoát. Tương tự, chúng đã phá cản hàn tại vàm Kỳ Hôn và chạy thoát hai tầm đạn của hai pháo đài bảo vệ. Trong thành, Tuần phủ Nguyễn Hữu Thành và Án sát Huỳnh Mẫn Đạt biết không thể nào giữ được nên trưa ngày 12-4-1861, đã ra lệnh thiêu hủy toàn bộ kho tàng, gom vũ khí và tài liệu rút về Vĩnh Long ba giờ trước khi tàu địch đến.
Tổng đốc Long Tường là Trương Văn Uyển phái Án sát Nguyễn Duy Quang và Lãnh binh Tôn Thất Tuấn đem 1.000 quân Vĩnh Long cứu viện Định Tường. Đội quân này đóng bên hữu, ngoài thành. Thấy tình thế không giữ thành được đã cùng quân Định Tường rút về Vĩnh Long.
Nhà Nguyễn trước đây đã xếp Định Tường là một tỉnh nhỏ, lệ thuộc tỉnh Vĩnh Long. Khi quân viễn chinh Pháp và Tây Ban Nha chiếm Gia Định, vua Tự Đức thấy rõ nhược điểm, đã nâng Định Tường thành tỉnh lớn, cử Hộ lý An Hà Tổng đốc là Nguyễn Công Nhàn làm Tổng đốc Định Tường để đủ quyền điều động dân binh. Thế nhưng khi nhận được lệnh, Nguyễn Công Nhàn đến Định Tường thì thành đã bị mất.
Hai ngày sau, quân Pháp chiếm được Tân Hòa (Gò Công).
Có thể nói lúc liên quân viễn chinh Pháp và Tây Ban Nha nã phát đại bác tấn công ba tỉnh miền Đông Nam kỳ thì triều đình Huế chưa có dấu hiệu đầu hàng. Quan quân địa phương vẫn còn hăng hái xông ra chiến trường diệt giặc. Họ được nhân dân ủng hộ từ tài lực, vật lực và sẵn sàng đóng góp xương máu cho chiến trường. Khi Pháp mới tấn công Gia Định, lực lượng ta cầm cự được 2 năm. Nhưng sau khi Pháp thắng trận ở Trung Quốc thì cục diện cuộc chiến đã thay đổi nhanh chóng, bất ngờ.
Phó đô đốc Charner hay tin quân viễn chinh Pháp chiếm được Mỹ Tho đã đến nơi sắp xếp việc hành chính, chính trị và lo việc giữ thành. Tại Mỹ Tho có 400 quân do Trung tá Desvaux chỉ huy; số còn lại thì rút về Sài Gòn, hoặc rải ra đóng ở các vị trí xung yếu, như các đồn Rạch Gầm, đồn Bourdais, Trấn Định, Trung Lương, Cai Lậy (do Chasseriau chỉ huy), Cái Bè (do Bottet và Goun chỉ huy), Kỳ Hôn (do Thouroude chỉ huy), chợ cũ Mỹ Tho, Gia Thạnh (do Robinet và Pineau), Gò Công (do D’Arieuille), Chợ Gạo… Nhằm ngăn chặn quân ta chiếm lại tỉnh thành, quân Pháp cho vét kinh Bảo Định để đảm bảo lưu thông, liền mạch với Sài Gòn. Chúng cho các pháo hạm án ngữ vàm Rạch Gầm, vàm Cái Thia, Cái Cối, cửa Tiểu, Mỹ Tho. Chúng tuyên bố sử dụng lại bộ máy chính quyền cấp xã và cấp tổng để tập họp một số Việt gian, tiến hành công việc hành chính, thuế vụ… Nhưng nhân dân nhất quyết không để cho giặc tự do hành động mặc dù quan quân của triều đình đã rút lui sang các tỉnh lân cận.
Các quan triều đình như Tổng đốc Nguyễn Công Nhàn chạy về Kiến Đăng, Tuần phủ Nguyễn Hữu Thành chạy về Biên Hòa, đều dâng sớ chịu tội, đổ lỗi cho nhau. Vua Tự Đức và các đại thần trong triều, từ khi mất ba tỉnh miền Đông chỉ họp bàn loanh quanh, chưa tìm được kế sách cứu nước. Vua chỉ ra lệnh cho ba tỉnh Bình Thuận, Khánh Hòa và Bình Định, mỗi tỉnh phải xuất 500 quân kéo vào Biên Hòa, hai tỉnh Vĩnh Long và An Giang phải hỗ trợ cho Định Tường và cho các quan bại trận ở Định Tường phải trở về lập công chuộc tội.
Phong trào kháng chiến chống Pháp bùng lên mạnh mẽ.
Lúc ấy, Đỗ Thúc Tịnh và Biện lý bộ Binh và Nguyễn Túc Trưng là Tuần phủ Thừa Thiên tự nguyện xin vào Nam đánh giặc nên được sung chức Khâm phái Quân vụ, được lệnh chiêu mộ dân quân chống giặc. Đoàn Khâm phái Quân vụ được bổ sung thêm nhiều quan lại yêu nước như Trương Minh Lượng, Nguyễn Nhã, Phan Trung, Võ Duy Dương…
Theo Đại Nam thực lục chính biên, lúc bấy giờ Thiên hộ Dương và lực lượng quân đồn điền từ Nam ra Quảng Ngãi dẹp giặc cũng theo đoàn Khâm phái Quân vụ trở về Nam. Vua Tự Đức phong Đỗ Thúc Tịnh làm Tuần phủ Định Tường. Thúc Tịnh xin cho triệu tập quân sĩ, tích trữ lương, chọn chỗ hiểm để lập đồn, luyện quân phòng giữ. Lại xin cho xuất tiền thuê người Hoa và người Âu ở Gia Định làm nội ứng. Đỗ Thúc Tịnh được quyền hành lớn, công việc đang tiến hành thì tử trận khoảng đầu năm 1862.